Una visión general de Legionella
Diane Miskowski, MPH
Legionella Experto en la materia
EMSL Analytical, Inc.
© Noviembre de 2017
Fondo
El primer brote reconocido de legionelosis ocurrió en Estados Unidos durante la Convención de la Legión Americana en Filadelfia, en el verano de 1976. Varios cientos de personas resultaron afectadas, y 34 fallecieron. Gracias a los esfuerzos de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de Estados Unidos, esta fue la primera vez que se cultivó e identificó la bacteria. Los brotes anteriores no se habían diagnosticado. Desde entonces, se han identificado numerosos brotes en Estados Unidos y en el extranjero, lo que ha impulsado a organizaciones profesionales y departamentos de salud de todo el mundo a implementar directrices y regulaciones para el diagnóstico y la notificación de la enfermedad, el monitoreo del microorganismo y la aplicación de medidas correctivas. En 2015, a raíz de un brote que afectó a más de 100 personas, tanto el Departamento de Salud del Estado de Nueva York como el Departamento de Salud e Higiene Mental de la Ciudad de Nueva York aprobaron una legislación pionera para torres de refrigeración e instalaciones sanitarias.
Al mismo tiempo que se producían los brotes en el Bronx, Nueva York, la Sociedad Estadounidense de Ingenieros de Calefacción, Refrigeración y Aire Acondicionado (ASHRAE) aprobó una norma profesional voluntaria titulada AHSRAE 188: Legionelosis: Gestión de Riesgos para Sistemas de Agua en Edificios. Estos dos acontecimientos históricos contribuyeron a dar mayor visibilidad a la legionelosis como una enfermedad gravemente subestimada. Es importante destacar que no existen normas ni reglamentos sanitarios para una exposición segura a la legionela, ya que se desconocen las dosis infecciosas tanto para personas sanas como para personas inmunodeprimidas.
Transmisión y epidemiología
Presente en todos los entornos acuáticos, Legionella Las bacterias se encuentran en las aguas subterráneas, el agua potable y las aguas superficiales dulces, salobres y marinas. Estas bacterias ingresan a nuestros sistemas de plomería, jacuzzis y torres de enfriamiento a través de estas fuentes de agua. Si no se implementan medidas de control adecuadas y de forma rutinaria, la biopelícula, la incrustación y la corrosión que aumentan con el tiempo en estos sistemas protegerán al organismo y le permitirán multiplicarse.
El agua contaminada proveniente de torres de refrigeración, bañeras de hidromasaje, nebulizadores, grifos y cabezales de ducha se convierte en aerosol. Cuando una persona susceptible inhala este aerosol contaminado, puede contraer legionelosis. La aspiración de agua contaminada o de hielo derretido también puede causar la enfermedad. Legionella Puede provocar una forma muy grave de neumonía (enfermedad del legionario), a menudo acompañada de graves consecuencias para la salud a largo plazo, o bien, una enfermedad leve y transitoria similar a la gripe, conocida como fiebre de Pontiac. Pueden producirse infecciones sanguíneas, infecciones de órganos, afectación de válvulas cardíacas nativas y protésicas, reemplazos protésicos de cadera y rodilla, e infecciones asintomáticas.
Los factores de riesgo incluyen la edad, el sexo (masculino), sistemas inmunitarios comprometidos y afecciones médicas preexistentes como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, el cáncer, la diabetes, la insuficiencia renal, el asma, el uso de fármacos inmunosupresores y la quimioterapia. Los hombres mayores de 50 años con sistemas inmunitarios comprometidos, los fumadores empedernidos y los bebedores frecuentes son los que corren mayor riesgo. Sin embargo, se han registrado casos de la enfermedad en personas jóvenes y sanas, así como en mujeres. Los recién nacidos prematuros, inmunocomprometidos o que requieren ventilación mecánica también corren riesgo de contraer la infección en el hospital. Algunos bebés nacidos en partos caseros con agua del grifo también han desarrollado legionelosis, lo que ha provocado septicemia, insuficiencia orgánica y la muerte.
Si bien anteriormente se creía que Legionella no era contagioso; hubo 2 casos que ocurrieron en Portugal que los investigadores sospechan que se transmitieron de hijo a madre basándose en la aparición temporal de las dos enfermedades y las huellas moleculares idénticas de los aislados obtenidos de las bacterias de los dos pacientes (Correia et al. 2016).
La legionelosis suele estar infradiagnosticada. La mayoría de los casos se deben a sistemas de agua potable en edificios y ocurren con frecuencia en hoteles y centros sanitarios. Los brotes que afectan a un mayor número de personas están asociados a torres de refrigeración. Para consultar la lista completa de sistemas de agua relacionados con casos y brotes, visite este enlace: http://www.legionellatesting.com/legionella-where-to-look.htm
Si bien los brotes adquiridos en la comunidad que involucran torres de enfriamiento y jacuzzis reciben la mayor atención de los medios, los estudios indican que las fuentes de agua potable de los edificios representan la mayoría de las infecciones. Esto es particularmente cierto en hospitales y residencias de ancianos donde hay un gran número de personas inmunodeprimidas o gravemente enfermas. Por estas razones, muchos departamentos de salud estatales tienen pautas que recomiendan el monitoreo rutinario de Legionella en hospitales de cuidados intensivos y residencias de ancianos. En agosto de 2014, la Administración de Veteranos (VA) elaboró una directiva que exige a todos los centros de la VA que ofrecen atención nocturna que implementen el monitoreo de sus sistemas de agua potable. Asimismo, existen directrices preliminares para la prevención de la legionelosis en los sistemas de agua de los edificios, elaboradas por la Sociedad Estadounidense de Ingenieros de Calefacción, Refrigeración y Aire Acondicionado (ASHRAE).
Recientemente, los CDC publicaron estadísticas que indican que la tasa de mortalidad de los casos adquiridos en la comunidad es de aproximadamente 10%, mientras que los casos adquiridos en el ámbito sanitario tienen una tasa de mortalidad de hasta 25%.
Selección de métodos de muestreo
Es necesario emplear métodos adecuados para la recolección y el análisis de muestras, a fin de garantizar resultados fiables basados en el tamaño de muestra correcto. Asimismo, es fundamental asegurar la toma de un número representativo de muestras antes de interpretar los resultados. Dado que las bacterias presentes en el agua potable se encuentran en concentraciones muy bajas, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de Estados Unidos recomiendan una muestra de 1000 mililitros (ml). Este tamaño de muestra permite concentrar las bacterias en el agua, lo que facilita una detección y cuantificación más precisas. Numerosas guías profesionales recomiendan el muestreo semestral de las fuentes de agua potable.
En fuentes de agua no potable, como el agua de las torres de refrigeración, una muestra de 250 ml es suficiente. Las directrices profesionales sugieren que estas fuentes se controlen trimestralmente.
El muestreo debe realizarse de forma que se maximice la recuperación del organismo y se imite la vía de exposición. Legionella Se deben recoger muestras siempre que pueda producirse la aerosolización del agua.
Sin embargo, analizar únicamente el agua probablemente no permitirá detectar la verdadera fuente del organismo. El reservorio real de la bacteria es la biopelícula o capa viscosa que siempre se encuentra en nuestras tuberías, torres de refrigeración y bañeras de hidromasaje.
La biopelícula (moco) está compuesta por otras bacterias, algas verdeazuladas, amebas y protozoos. La biopelícula protege Legionella por la exposición directa a la luz ultravioleta (UV), la desecación y los productos químicos utilizados para controlar su crecimiento. Legionella Las bacterias son ingeridas por los protozoos y las amebas y continuarán multiplicándose dentro de estos organismos. La infección de estos organismos huéspedes les causará la muerte, liberando enormes cantidades de Legionella bacterias en el entorno circundante. Esto es exactamente lo que sucede dentro de nuestro cuerpo cuando nuestros macrófagos pulmonares se infectan con bacterias. Legionella.
Porque la biopelícula protege al organismo y mejora Legionella multiplicación, incorporar hisopos en su protocolo de muestreo es muy importante. El muestreo con hisopos de biopelícula que se encuentra en sumideros de torres de enfriamiento, grifos de agua potable, cabezales de ducha y filtros de spas de hidromasaje es necesario para obtener una imagen real de la presencia de Legionella. Muy a menudo, las muestras de hisopado de biopelícula demuestran la presencia de Legionella no detectado mediante el muestreo de agua únicamente. Tomar muestras con hisopos del agua potable y de las máquinas de hielo puede revelar Legionella contaminación debida al estancamiento del agua.
Mientras se recolectaban muestras de aire para Legionella Aunque imita la vía de exposición, este método de muestreo no se recomienda para proyectos que no sean de investigación. Durante el muestreo de aire, es probable que las bacterias mueran al impactar las células bacterianas en el medio de recolección.
Legionella Es improbable que sobrevivan a la exposición a la luz solar y a la desecación durante largos períodos de tiempo. La transmisión aérea de Legionella desde las torres de refrigeración es mayor durante los períodos de días nublados y con alta humedad, y después de las lluvias (Simmerling et al., 2017).
Al tomar muestras, se debe usar una mascarilla respiratoria N95 o HEPA, una careta protectora o gafas de protección contra salpicaduras y guantes impermeables. Al tomar muestras de tanques de almacenamiento de agua caliente, es recomendable usar una careta protectora, un delantal térmico y guantes térmicos resistentes al agua. Tenga cuidado de no generar aerosoles al recolectar las muestras. Solo se deben usar botellas estériles y debidamente conservadas, así como hisopos estériles de dacrón (no de algodón) proporcionados por su laboratorio. Las botellas de agua potable deben conservarse con tiosulfato de sodio para neutralizar los biocidas halogenados presentes en la muestra de agua.
Estas botellas conservadas también deben utilizarse para recoger agua de torres de refrigeración que hayan sido tratadas con compuestos de cloro o bromo.
Después de recoger una muestra de agua, asegúrese de dejar un espacio de aire en la botella. Dado que Legionella Dado que necesitan oxígeno para sobrevivir, un espacio de aire en la botella garantizará que se mantengan las condiciones aeróbicas durante el envío al laboratorio.
Las muestras deben ser empaquetadas y enviadas para minimizar la multiplicación de no-Legionella bacterias. Se recomienda usar una nevera portátil isotérmica con acumuladores de frío para evitar temperaturas extremas durante el envío. Las muestras deben enviarse al laboratorio con entrega al día siguiente.
Métodos analíticos - Prueba de cultivo
Legionella Son bacterias aerobias y exigentes; tienen requisitos muy estrictos para su crecimiento. Dos de estos requisitos son la presencia de hierro y cisteína. Son gramnegativas débiles y crecen lentamente en comparación con otras bacterias. Legionella A menudo son superadas por bacterias de crecimiento más rápido. Su crecimiento puede ser inhibido por otras bacterias, la más común P. aeruginosa, que se encuentra comúnmente en biopelículas. Legionella no crecen en medios microbiológicos estándar utilizados para recuentos de placas aerobias o en agar selectivo utilizado para detectar otros microorganismos noLegionella patógenos.
Actualmente, el método más reconocido en los EE. UU. para identificar y cuantificar Legionella en muestras clínicas y ambientales es el método de cultivo. Este método utiliza un procedimiento mejorado desarrollado por la Organización Internacional de Normalización (ISO). Este método incorpora la concentración rutinaria, el tratamiento ácido y el tratamiento térmico de todas las muestras de agua potable y no potable para mejorar la recuperación de niveles muy bajos de Legionela en cualquier muestra. El agar de extracto de levadura y carbón activado tamponado (BCYE) con antibióticos es la formulación base a la que se añaden suplementos adicionales para controlar los no-Legionella bacterias y recuperar más Legionella especies.
Las muestras deben concentrarse para poder recuperar bajas concentraciones de Legionella. Esto se suele hacer filtrando toda la muestra a través de un filtro de membrana estéril. A continuación, el filtro se agita en un vórtex con agua destilada estéril. Luego se toman alícuotas para sembrarlas en 4 formulaciones diferentes de agar BCYE. El agua no potable suele tener una alta concentración de bacterias que inhiben el crecimiento de Legionella. Desde Legionella son más resistentes a niveles de pH ácidos, estas muestras se tratan previamente con una solución ácida tamponada para eliminar los no-Legionella bacterias.
Las muestras que contienen grandes cantidades de protozoos, como las aguas residuales municipales o las aguas residuales de las fábricas de papel, requieren un pretratamiento térmico. El pretratamiento térmico es necesario para matar los protozoos y así liberar los Legionella para que puedan ser recuperados, cultivados y cuantificados.
Las placas BCYE se incuban a
35-370 F (que es la temperatura corporal) en lugar de la temperatura ambiente. Dado que Legionella Las bacterias crecen lentamente; los periodos de incubación son de 7 días para confirmar un resultado positivo y de al menos 10 días para confirmar un resultado negativo. Por este motivo, los métodos de cultivo no deben apresurarse.
Tras 72 a 96 horas, las colonias se examinan utilizando un microscopio de disección con luz ultravioleta. Legionella Las colonias se presentan como colonias blancas circulares y convexas con un centro que se asemeja a vidrio esmerilado. A menudo, las colonias exhiben autofluorescencia azul-blanca, verde o roja.
Estos sospechosos Legionella Las colonias se siembran en placas BCYE que no contienen hierro ni cisteína. Si las colonias sospechosas no crecen en estas placas BCYE, se identifican presuntamente como Legionella.
Las colonias presuntivas se analizan luego mediante anticuerpos de fluorescencia directa (DFA) o aglutinación de látex para confirmar la identificación de especies e identificar los serotipos. Dado que Legionella en muestras ambientales crecen lentamente, un resultado negativo confirmado de la muestra debe proporcionarse solo después de los 10el día de incubación.
Debido a la reactividad cruzada y al potencial de resultados falsos positivos y falsos negativos, la DFA debe utilizarse únicamente en colonias puras obtenidas tras la incubación. Según los CDC, la DFA no debe utilizarse directamente en muestras de agua ambiental, como afirman algunos laboratorios.
Si bien se estima que el 851% de los brotes en los EE. UU. son causados por L. pneumophila serotipo 1, existen otros serotipos de L. pneumophila e incluso otros Legionella especies que pueden causar la enfermedad. No todos los laboratorios emplean el mismo método para aislar e identificar el organismo. Averigüe si su laboratorio utiliza el método que le permita obtener el nivel de identificación y cuantificación que necesita.
En Estados Unidos, los resultados del método de cultivo se expresan en unidades formadoras de colonias por UFC/mililitro (UFC/ml). En otros países, se suelen expresar en UFC/litro (UFC/L). Si bien es práctica microbiológica estándar expresar los resultados en UFC/ml, esto puede resultar confuso para quienes no son microbiólogos.
Métodos analíticos: reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una prueba genética que busca el ácido desoxirribonucleico (ADN) que es específico para Legionella. Si bien la PCR no se considera el “estándar de oro” para Legionella análisis en los EE. UU., es muy útil para determinar rápidamente la presencia o ausencia de Legionella en una muestra. Dado que se pueden obtener resultados el mismo día, el rápido tiempo de respuesta puede ser útil para confirmar la presencia de Legionella durante un brote, cuando el tiempo es crucial.
A diferencia de los análisis de cultivo, donde la variabilidad inter e intralaboratorio es alta, los resultados de la PCR son reproducibles, exactos, precisos y muy sensibles. El límite de detección es, teóricamente, un único fragmento de ADN.
La PCR mide el ADN asociado tanto a células viables como no viables. Legionella. El método de cultivo solo mide las bacterias viables que crecerán en los medios selectivos.
La principal desventaja de la PCR radica en el potencial de efectos de la matriz de la muestra. La presencia de cationes divalentes comunes, como calcio, magnesio o plata, y la forma divalente del cobre, pueden provocar falsos negativos si las muestras no se procesan correctamente. Esto exige que el laboratorio cuente con un riguroso programa de control de calidad que incluya controles positivos, negativos y de la matriz de la muestra.
Otras desventajas de la PCR son que no puede identificar individualmente las 50 especies conocidas que causan enfermedades y no puede identificar todos los serotipos de estas especies. Si bien la mayoría de los laboratorios de PCR pueden identificar L. pneumophila, Puede haber otras especies o serotipos colonizando su sistema de agua o causando la enfermedad que usted desea identificar. Como resultado de un nuevo procedimiento de prueba, ahora es posible identificar L. pneumophila serotipo 1 mediante PCR.
Los no microbiólogos suelen confundir los términos género, especie, serotipo y cepa. Estos son términos independientes para la identificación de organismos y cada uno se utiliza para alcanzar un nivel de identificación sucesivamente más específico. (es decir, Legionella pneumophila, serotipo 1, Filadelfia es la identificación del género (Legionella), especies (neumofila), serotipo (1) y cepa (Philadelphia) que causaron el brote de 1976 en Filadelfia.
El método de cultivo proporciona cuantificación e identificación de Legionella especies y serotipos. Actualmente, el número limitado de laboratorios comerciales que utilizan PCR solo identifican a nivel de especie. Al momento de escribir esto, EMSL es el único laboratorio comercial que tiene un método de PCR validado para determinar Legionella spp., Legionella pneumophila, y Legionella pneumophila Serotipo 1 (Lp1) en la misma prueba. La identificación de especies y serotipos no es suficiente para determinar la fuente real de la contaminación durante un brote. Durante una investigación epidemiológica, es necesario emplear la identificación de cepas para determinar si las bacterias en las muestras clínicas coinciden con las bacterias encontradas en las muestras ambientales.
En los EE. UU., la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) fue el método más comúnmente utilizado para identificar cepas dentro L. pneumophila serogrupo 1 y otras especies. Sin embargo, técnicas moleculares más recientes como la tipificación basada en secuencias (SBT), que examina siete genes específicos dentro de Lp1, así como la secuenciación del genoma completo (WGS), que puede discriminar entre los aproximadamente 3,4 millones de genes de la bacteria, son utilizadas por los CDC, algunos departamentos de salud estatales y el Grupo de Trabajo Europeo para Legionella Infecciones (EWGLI) para subtipificación L. pneumophila serogrupo 1 e identificación de la fuente. El uso de PFGE y SBT no tiene suficiente poder discriminatorio para identificar cepas de Lp1 o para identificar mutaciones genéticas en Lp1 u otras especies y serotipos. (LaPierre et al., 2017). Por lo tanto, solo la secuenciación del genoma completo (WGS) puede utilizarse para el rastreo de la fuente. Al momento de redactar este informe, EMSL es el único laboratorio comercial que puede proporcionar los datos brutos de WGS para su uso en el rastreo de la fuente.
Objetivo del seguimiento de la evaluación de riesgos
La intención de su Legionella La evaluación de riesgos determinará el tipo de datos que necesita. Se realiza un monitoreo proactivo para determinar las condiciones de referencia y las concentraciones de Legionella o para validar la efectividad de un programa de mantenimiento existente en ausencia de casos sospechosos de legionelosis. Con este tipo de monitoreo se obtiene un resultado cualitativo, presente/ausente o un resultado cuantitativo. Legionella La identificación de la especie y el serotipo es suficiente. No se requiere identificación de cepa ni subtipificación.
Se realiza un seguimiento reactivo ante un caso sospechoso o confirmado de legionelosis. En estos casos, es necesaria la cuantificación de especies y serotipos individuales. Para la investigación epidemiológica de un brote, solo la secuenciación del genoma completo tiene la capacidad de determinar si las huellas moleculares de las muestras ambientales y clínicas están relacionadas.
Ya sea que su evaluación de riesgos sea proactiva o reactiva, los resultados deben indicar cantidades predominantemente no detectables (ND) de bacterias.
La concentración real proporciona información útil sobre el grado de contaminación. Sin embargo, debe entenderse que las concentraciones son relativas y no un valor absoluto. Las poblaciones bacterianas están en constante cambio: las células bacterianas se multiplican, mueren o permanecen latentes. Dado que las bacterias se multiplican logarítmicamente, una diferencia de un orden de magnitud (10x) en los resultados entre los periodos de muestreo es significativa. Una diferencia de unas pocas UFC o una pequeña multiplicación de los resultados no es significativa. El objetivo es demostrar un historial de resultados no detectables a lo largo del tiempo.
En resumen, el método analítico utilizado determina el tipo y la precisión de los resultados. Al utilizar agares BCYE para aislar Legionella es el “estándar de oro” reconocido mundialmente, todavía hay algunos laboratorios que utilizan otros métodos. Además, los reactivos y métodos utilizados para Legionella Los métodos de identificación no están estandarizados. Esto dificulta enormemente la comparación de resultados de laboratorios distintos. Asegúrese de identificar tanto el método de aislamiento como el de identificación que utiliza cada laboratorio. De esta manera, podrá llegar a conclusiones correctas al comparar los resultados y obtener la información detallada que necesita.
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