Aperçu de légionelles
Diane Miskowski, MPH
légionelles Expert en la matière
EMSL Analytical, Inc.
© Novembre 2017
Arrière-plan
La première épidémie de légionellose recensée aux États-Unis a eu lieu lors du congrès de l'American Legion à Philadelphie, durant l'été 1976. Plusieurs centaines de personnes ont été touchées et 34 en sont décédées. Grâce aux efforts des Centres américains de contrôle et de prévention des maladies (CDC), la bactérie a été cultivée et identifiée pour la première fois. Les épidémies précédentes étaient restées non diagnostiquées. Depuis, de nombreuses épidémies ont été identifiées aux États-Unis et à l'étranger, incitant les organisations professionnelles et les services de santé du monde entier à mettre en œuvre des directives et des réglementations pour le diagnostic et la déclaration de la maladie, la surveillance de la bactérie et la mise en place de mesures d'assainissement. En 2015, suite à une épidémie ayant touché plus de 100 personnes, le Département de la santé de l'État de New York et le Département de la santé et de l'hygiène mentale de la ville de New York ont adopté une législation novatrice concernant les tours de refroidissement et les établissements de santé.
Au même moment où les épidémies se déclaraient dans le Bronx (New York), l'American Society of Heating, Refrigeration, and Air Conditioning Engineers (ASHRAE) adoptait une norme de pratique professionnelle volontaire intitulée AHSRAE 188 : « Légionellose : Gestion des risques liés aux réseaux d'eau des bâtiments ». Ces deux événements historiques ont permis de mieux faire connaître la légionellose, une maladie largement sous-diagnostiquée. Il est important de souligner qu'il n'existe aucune norme sanitaire ni réglementation concernant les risques d'exposition à la légionelle, car les doses infectieuses pour les personnes en bonne santé et les personnes immunodéprimées sont inconnues.
Transmission et épidémiologie
Présent dans tous les milieux aquatiques, légionelles On trouve des bactéries dans les eaux souterraines, l'eau du réseau ainsi que dans les eaux de surface douces, saumâtres et marines. Ces bactéries pénètrent dans nos systèmes de plomberie, nos spas et nos tours de refroidissement par ces sources d'eau. Si des mesures de contrôle ne sont pas mises en œuvre correctement et régulièrement, le biofilm, le tartre et la corrosion qui s'accumulent avec le temps dans ces systèmes protégeront ces organismes et leur permettront de proliférer.
L'eau contaminée se propage par aérosolisation à partir des tours de refroidissement, des bains à remous, des nébuliseurs, des robinets et des pommeaux de douche. L'inhalation de ces aérosols contaminés peut provoquer une légionellose chez une personne sensible. L'aspiration d'eau contaminée ou de glace fondue peut également être à l'origine de la maladie. légionelles Elle peut provoquer une forme très grave de pneumonie (légionellose), souvent accompagnée de séquelles importantes à long terme, ou une maladie bénigne et transitoire de type grippal appelée fièvre de Pontiac. Des infections du sang, des infections d'organes, des atteintes aux valves cardiaques natives et prothétiques, aux prothèses de hanche et de genou, ainsi que des infections asymptomatiques peuvent survenir.
Les facteurs de risque comprennent l'âge, le sexe masculin, l'immunodéficience et des affections médicales préexistantes telles que la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), le cancer, le diabète, l'insuffisance rénale, l'asthme, la prise de médicaments immunosuppresseurs et la chimiothérapie. Les hommes de plus de 50 ans immunodéprimés, les fumeurs et les consommateurs d'alcool importants sont les plus à risque. Cependant, des cas de légionellose ont été observés chez des personnes jeunes et en bonne santé, ainsi que chez des femmes. Les nouveau-nés prématurés, immunodéprimés ou placés sous ventilation mécanique sont également exposés au risque d'infection nosocomiale. Des bébés nés dans des bassins d'accouchement à domicile remplis d'eau du robinet ont également contracté la légionellose, entraînant une septicémie, une défaillance multiviscérale et le décès.
Alors qu'on croyait auparavant que légionelles n'était pas contagieux ; il y a eu 2 cas survenus au Portugal que les chercheurs soupçonnent d'avoir été transmis du fils à la mère sur la base de l'apparition temporelle des deux maladies et des empreintes moléculaires identiques des isolats obtenus à partir des bactéries des deux patients (Correia et al. 2016).
La légionellose est systématiquement sous-déclarée. La plupart des cas sont liés aux réseaux d'eau potable des bâtiments et surviennent fréquemment dans les hôtels et les établissements de santé. Les épidémies touchant un plus grand nombre de personnes sont associées aux tours de refroidissement. Pour une liste complète des réseaux d'eau associés à des cas et des épidémies, veuillez consulter ce lien : http://www.legionellatesting.com/legionella-where-to-look.htm
Bien que les épidémies communautaires liées aux tours de refroidissement et aux spas à remous soient les plus médiatisées, des études indiquent que les sources d'eau potable des bâtiments sont responsables de la plupart des infections. C'est particulièrement vrai dans les hôpitaux et les maisons de retraite, où se trouvent de nombreuses personnes immunodéprimées ou gravement malades. Pour ces raisons, de nombreux services de santé publique ont publié des recommandations préconisant une surveillance régulière. légionelles Dans les services de soins intensifs et les établissements de soins de longue durée, l'Administration des anciens combattants (VA) a publié en août 2014 une directive exigeant que tous ses établissements proposant des soins de nuit mettent en place un système de surveillance de leurs réseaux d'eau potable. Par ailleurs, l'American Society of Heating, Refrigeration and Air Conditioning Engineers (ASHRAE) a élaboré des recommandations préliminaires pour la prévention de la légionellose dans les réseaux d'eau des bâtiments.
Le CDC a récemment publié des statistiques indiquant que le taux de mortalité des cas contractés dans la communauté est d'environ 10%, tandis que celui des cas contractés dans les établissements de santé peut atteindre 25%.
Choix des méthodes d'échantillonnage
Des méthodes appropriées de prélèvement et d'analyse des échantillons sont indispensables pour garantir des résultats fiables, fondés sur une taille d'échantillon adéquate. Il est également crucial de s'assurer qu'un nombre représentatif d'échantillons est prélevé avant d'interpréter les résultats. Étant donné que les bactéries sont présentes en très faible concentration dans l'eau potable, les Centres américains de contrôle et de prévention des maladies (CDC) recommandent un échantillon de 1 000 millilitres (ml). Cette taille d'échantillon permet de concentrer les bactéries présentes dans l'eau, ce qui améliore la sensibilité de détection et de quantification. De nombreuses recommandations professionnelles préconisent un échantillonnage semestriel des sources d'eau potable.
Pour les sources d'eau non potable, comme l'eau des tours de refroidissement, un échantillon de 250 ml est suffisant. Les recommandations professionnelles préconisent un suivi trimestriel de ces sources.
L’échantillonnage doit être effectué de manière à maximiser la récupération de l’organisme et à reproduire la voie d’exposition. légionelles Des échantillons doivent être prélevés partout où une aérosolisation de l'eau peut se produire.
Un simple prélèvement d'eau ne permettra probablement pas d'identifier la véritable source de l'organisme. Le réservoir réel de la bactérie est le biofilm ou la substance visqueuse que l'on trouve systématiquement dans nos canalisations, nos tours de refroidissement et nos bains à remous.
Le biofilm (ou mucus) est composé de bactéries, d'algues bleu-vert, d'amibes et de protozoaires. Le biofilm protège légionelles de l'exposition directe aux rayons ultraviolets (UV), de la dessiccation et des produits chimiques utilisés pour contrôler sa croissance. légionelles Les bactéries sont ingérées par les protozoaires et les amibes et continuent de se multiplier à l'intérieur de ces organismes. L'infection de ces organismes hôtes entraîne leur mort, libérant ainsi un grand nombre de bactéries. légionelles des bactéries dans l'environnement. C'est exactement ce qui se produit à l'intérieur de notre corps lorsque nos macrophages pulmonaires sont infectés par légionelles.
Car le biofilm protège l'organisme et améliore légionelles La multiplication bactérienne, et notamment l'intégration d'écouvillons à votre protocole d'échantillonnage, est très importante. L'échantillonnage par écouvillonnage du biofilm présent dans les puisards des tours de refroidissement, les robinets d'eau potable, les pommes de douche et les filtres des spas est nécessaire pour obtenir une image fidèle de la présence de ces micro-organismes. Légionelle. Très souvent, les prélèvements de biofilm démontrent la présence de légionelles indétectable par le seul échantillonnage de l'eau. Le prélèvement d'échantillons d'eau potable et de machines à glaçons peut révéler légionelles contamination due à la stagnation de l'eau.
Lors de la collecte d'échantillons d'air pour légionelles Bien que cette méthode d'échantillonnage imite la voie d'exposition, elle n'est pas recommandée pour les projets d'échantillonnage non liés à la recherche. Lors de l'échantillonnage de l'air, les bactéries sont probablement détruites par impaction des cellules bactériennes sur le support de collecte.
légionelles Il est peu probable que ces bactéries survivent longtemps à une exposition prolongée au soleil et à la dessiccation. La transmission de Legionella par voie aérienne depuis les tours de refroidissement est plus importante par temps nuageux et humide, ainsi qu'après les averses (Simmerling et al., 2017).
Lors du prélèvement d'échantillons, il est recommandé de porter un masque respiratoire N95 ou HEPA, une visière ou des lunettes de protection contre les projections, ainsi que des gants étanches. Pour le prélèvement d'échantillons dans les réservoirs d'eau chaude, il est conseillé de porter une visière, un tablier thermique et des gants thermiques et imperméables. Veillez à ne pas générer d'aérosols lors du prélèvement. Seuls des flacons stériles correctement conservés et des écouvillons stériles en Dacron (et non en coton) fournis par votre laboratoire doivent être utilisés. Les bouteilles d'eau potable doivent être conservées avec du thiosulfate de sodium afin de neutraliser les biocides halogénés présents dans l'échantillon d'eau.
Ces bouteilles stabilisées doivent également être utilisées pour la collecte d'eau provenant de tours de refroidissement traitées avec des composés chlorés ou bromés.
Après avoir prélevé un échantillon d'eau, veillez à laisser un espace d'air dans la bouteille. légionelles Ces bactéries ayant besoin d'oxygène pour survivre, un espace d'air dans le flacon garantira le maintien de conditions aérobies pendant le transport jusqu'au laboratoire.
Les échantillons doivent être emballés et expédiés de manière à minimiser la multiplication des non-légionelles bactéries. L'utilisation d'une glacière isotherme avec des blocs réfrigérants est recommandée afin d'éviter les variations de température pendant le transport. Les échantillons doivent être expédiés au laboratoire par transport express.
Méthodes analytiques - Test de culture
légionelles Ce sont des bactéries aérobies et exigeantes ; leur croissance nécessite des conditions très strictes. Parmi ces conditions figurent la présence de fer et de L-cystéine. Elles sont faiblement Gram négatives et leur croissance est lente comparée à celle d'autres bactéries. légionelles sont souvent envahies par des bactéries à croissance plus rapide. Leur croissance peut être inhibée par certaines autres bactéries, le plus souvent P. aeruginosa, que l'on retrouve fréquemment dans les biofilms. légionelles ne pas se développer sur les milieux microbiologiques standard utilisés pour les dénombrements aérobies sur plaque ou sur les géloses sélectives utilisées pour la détection d'autres bactéries non-aérobies.légionelles agents pathogènes.
Aux États-Unis, la méthode la plus couramment utilisée pour identifier et dénombrer Legionella dans les échantillons cliniques et environnementaux est la culture. Cette méthode repose sur une procédure améliorée mise au point par l'Organisation internationale de normalisation (ISO). Elle comprend la concentration, le traitement acide et le traitement thermique de routine de tous les échantillons d'eau potable et non potable afin d'améliorer la détection de très faibles concentrations de Legionella. Légiona dans n'importe quel échantillon. La gélose à l'extrait de levure et au charbon actif tamponné (BCYE) avec antibiotiques est la formulation de base à laquelle des suppléments supplémentaires sont ajoutés pour contrôler les non-légionelles bactéries et récupérer davantage légionelles espèces.
Les échantillons doivent être concentrés afin de récupérer de faibles concentrations de légionelles. On procède généralement en filtrant l'échantillon entier à travers une membrane stérile. Le filtre est ensuite vortexé dans de l'eau distillée stérile. Des aliquotes sont ensuite prélevées pour être ensemencées sur quatre formulations différentes de gélose BCYE. L'eau non potable contient souvent une forte concentration de bactéries qui inhibe la croissance de… légionelles. Depuis légionelles Ces échantillons, plus résistants aux niveaux de pH acides, sont prétraités avec une solution acide tamponnée pour éliminer les non-légionelles bactéries.
Les échantillons contenant de grandes quantités de protozoaires, tels que les eaux usées municipales ou celles des papeteries, nécessitent un prétraitement thermique. Ce prétraitement est nécessaire pour tuer les protozoaires et libérer les légionelles afin qu'ils puissent être récupérés, cultivés et quantifiés.
Les plaques BCYE sont incubées à
35-370 F (qui est la température corporelle) plutôt que la température ambiante. légionelles Les bactéries se développent lentement ; les périodes d’incubation sont de 7 jours pour confirmer un résultat positif et d’au moins 10 jours pour confirmer un résultat négatif. C’est pourquoi les méthodes de culture ne peuvent être précipitées.
Après 72 à 96 heures, les colonies sont examinées à l'aide d'un microscope stéréoscopique avec lumière UV. légionelles Les colonies se présentent sous forme de colonies blanches convexes et circulaires, dont le centre évoque du verre dépoli. Elles présentent souvent une autofluorescence bleu-blanc, verte ou rouge.
Ces suspects légionelles Les colonies sont ensemencées par stries sur des plaques BCYE dépourvues de fer et de cystéine. Si les colonies suspectes ne se développent pas sur ces plaques BCYE, elles sont présumées être… légionelles.
Les colonies présumées sont ensuite analysées par immunofluorescence directe (IFD) ou par agglutination au latex afin de confirmer l'identification des espèces et d'identifier les sérotypes. légionelles Dans les échantillons environnementaux, la croissance étant lente, un résultat négatif confirmé ne devrait être fourni qu'après 10 jours.ème Jour d'incubation.
En raison des réactions croisées et du risque de faux positifs et de faux négatifs, le test DFA ne doit être utilisé que sur des colonies pures obtenues après incubation. Selon les CDC, le test DFA ne doit pas être utilisé directement sur des échantillons d'eau environnementaux, contrairement à ce que prétendent certains laboratoires.
Bien qu'on estime que 85% des épidémies aux États-Unis soient causées par L. pneumophila sérotype 1, il existe d'autres sérotypes de L. pneumophila et même d'autres légionelles Les espèces susceptibles de provoquer la maladie peuvent être identifiées par différentes méthodes. Tous les laboratoires n'utilisent pas la même méthode d'isolement et d'identification de l'organisme. Assurez-vous que votre laboratoire utilise la méthode permettant d'obtenir le niveau d'identification et de quantification requis.
Aux États-Unis, les résultats obtenus par la méthode de culture sont exprimés en unités formant colonies par millilitre (UFC/ml). Dans d'autres pays, ils sont généralement exprimés en UFC par litre (UFC/L). Bien que l'expression en UFC/ml soit la norme en microbiologie, elle peut prêter à confusion pour les non-spécialistes.
Méthodes analytiques - Réaction en chaîne par polymérase
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est un test génétique qui recherche l'acide désoxyribonucléique (ADN) spécifique à une mutation. légionelles.Bien que la PCR ne soit pas considérée comme la “ référence absolue ” pour légionelles Aux États-Unis, cette analyse est très utile pour déterminer rapidement la présence ou l'absence de légionelles dans un échantillon. Étant donné que les résultats peuvent être obtenus le jour même, ce délai d'exécution rapide peut s'avérer utile pour confirmer la présence de légionelles en période d'épidémie, lorsque le temps est un facteur critique.
Contrairement aux analyses de culture, où la variabilité inter- et intra-laboratoire est élevée, les résultats de la PCR sont reproductibles, exacts, précis et très sensibles. La limite de détection est théoriquement d'un seul fragment d'ADN.
La PCR mesure l'ADN associé aux cellules viables et non viables. légionelles. La méthode de culture ne permet de mesurer que les bactéries viables qui se développeront sur le milieu sélectif.
Le principal inconvénient de la PCR réside dans le risque d'effets de matrice. La présence de cations divalents courants, tels que le calcium, le magnésium ou l'argent, ainsi que du cuivre divalent, peut entraîner des résultats faussement négatifs si les échantillons ne sont pas traités correctement. Il est donc indispensable que le laboratoire dispose d'un programme d'assurance qualité rigoureux comprenant des contrôles positifs, négatifs et de matrice.
Parmi les autres inconvénients de la PCR, on peut citer son incapacité à identifier individuellement les 50 espèces connues pour être pathogènes, ni tous les sérotypes de ces espèces. Bien que la plupart des laboratoires de PCR puissent identifier L. pneumophila, D'autres espèces ou sérotypes peuvent coloniser votre réseau d'eau ou être à l'origine de la maladie que vous souhaitez identifier. Grâce à une nouvelle procédure de test, il est désormais possible de les identifier. L. pneumophila sérotype 1 par PCR.
Les non-microbiologistes confondent souvent les termes genre, espèce, sérotype et souche. Ce sont des termes indépendants utilisés pour l'identification des organismes et chacun permet d'atteindre un niveau d'identification successivement plus précis., Legionella pneumophila, Le sérotype 1, Philadelphie, est l'identification du genre (légionelles), espèces (pneumophilie), sérotype (1) et souche (Philadelphie) qui a provoqué l’épidémie de 1976 à Philadelphie.
La méthode de culture permet la quantification et l'identification de légionelles espèces et sérotypes. Actuellement, le nombre limité de laboratoires commerciaux utilisant la PCR ne permet d'identifier que l'espèce. À ce jour, EMSL est le seul laboratoire commercial disposant d'une méthode PCR validée pour la détermination de l'espèce. légionelles spp., Legionella pneumophila, et Legionella pneumophila Le sérotype 1 (Lp1) a été détecté lors du même test. L'identification de l'espèce et du sérotype ne suffit pas à déterminer la source exacte de la contamination lors d'une épidémie. Au cours d'une enquête épidémiologique, il est nécessaire d'identifier la souche bactérienne afin de déterminer si les bactéries présentes dans les échantillons cliniques correspondent à celles retrouvées dans les échantillons environnementaux.
Aux États-Unis, l'électrophorèse en champ pulsé (PFGE) était la méthode la plus couramment utilisée pour identifier les souches au sein de L. pneumophila le sérogroupe 1 et d'autres espèces. Cependant, des techniques moléculaires plus récentes, telles que le typage basé sur la séquence (SBT), qui analyse sept gènes spécifiques au sein de Lp1, ainsi que le séquençage du génome entier (WGS), capable de discriminer parmi les quelque 3,4 millions de gènes de la bactérie, sont utilisées par les CDC, certains services de santé publique d'État et le Groupe de travail européen pour légionelles Infections (EWGLI) pour le sous-typage L. pneumophila Sérogroupe 1 et identification de la source. L'utilisation des techniques PFGE et SBT ne possède pas un pouvoir discriminant suffisant pour identifier les souches de Lp1 ni les mutations génétiques chez Lp1 ou d'autres espèces et sérotypes. (LaPierre et al., 2017). Par conséquent, seul le séquençage du génome entier (WGS) peut être utilisé pour le traçage des sources. À l'heure actuelle, EMSL est le seul laboratoire d'essais commercial capable de fournir les données brutes WGS nécessaires au traçage des sources.
Objectif du suivi de l'évaluation des risques
L'intention de votre légionelles L'évaluation des risques déterminera le type de données nécessaires. Une surveillance proactive est mise en œuvre pour déterminer les conditions de référence et les concentrations de légionelles ou pour valider l'efficacité d'un programme de maintenance existant en l'absence de cas suspects de légionellose. Ce type de suivi peut donner un résultat qualitatif (présence/absence) ou un résultat quantitatif. légionelles L'indication de l'espèce (spp.) est suffisante. L'identification de l'espèce et du sérotype est facultative. L'identification de la souche ou le sous-typage ne sont pas nécessaires.
Une surveillance réactive est mise en œuvre lorsqu'un cas suspecté ou confirmé de légionellose survient. Dans ce cas, la quantification des espèces et des sérotypes est nécessaire. Pour une enquête épidémiologique sur une épidémie, seul le séquençage du génome entier permet de déterminer si les profils moléculaires des échantillons environnementaux et cliniques sont liés.
Que votre évaluation des risques soit proactive ou réactive, les résultats devraient indiquer des quantités majoritairement non détectables (ND) de bactéries.
La concentration mesurée fournit des informations utiles sur le degré de contamination. Il est important de noter que les concentrations sont relatives et non absolues. Les populations bactériennes sont en constante évolution : les cellules se multiplient, meurent ou entrent en dormance. Comme les bactéries se multiplient de façon logarithmique, une différence d'un ordre de grandeur (10 fois) entre les résultats des différentes périodes d'échantillonnage est significative. En revanche, une différence de quelques UFC ou une multiplication des résultats par un seul chiffre ne l'est pas. L'objectif est de démontrer un historique de résultats non détectables au fil du temps.
En résumé, la méthode analytique utilisée détermine le type et la précision des résultats. Lors de l'utilisation de géloses BCYE pour l'isolement légionelles Bien que cette méthode soit reconnue comme la référence mondiale, certains laboratoires utilisent encore d'autres méthodes. De plus, les réactifs et les méthodes utilisés pour légionelles Les méthodes d'identification ne sont pas standardisées, ce qui rend la comparaison des résultats de deux laboratoires différents très difficile. Il est donc essentiel d'identifier la méthode d'isolement et les méthodes d'identification utilisées. Cela vous permettra de tirer des conclusions pertinentes lors de la comparaison des résultats et d'obtenir le niveau de détail nécessaire.
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