Uma visão geral de Legionella
Diane Miskowski, MPH
Legionella Especialista no assunto
EMSL Analytical, Inc.
© Novembro de 2017
Fundo
O primeiro surto reconhecido de doença dos legionários ocorreu nos EUA durante a Convenção da Legião Americana na Filadélfia, no verão de 1976. Centenas de pessoas foram infectadas e 34 morreram em decorrência da doença. Graças aos esforços dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) dos EUA, essa foi a primeira vez que a bactéria foi cultivada e identificada. Surtos anteriores da doença não foram diagnosticados. Desde então, muitos surtos foram identificados nos EUA e no exterior, levando organizações profissionais e departamentos de saúde em todo o mundo a implementar diretrizes e regulamentações para o diagnóstico e notificação da doença, monitoramento do organismo e implementação de medidas corretivas. Em 2015, em decorrência de um surto que afetou mais de 100 pessoas, o Departamento de Saúde do Estado de Nova York e o Departamento de Saúde e Higiene Mental da Cidade de Nova York aprovaram legislação inovadora para torres de resfriamento e instalações de saúde.
Simultaneamente aos surtos no Bronx, em Nova York, a Sociedade Americana de Engenheiros de Aquecimento, Refrigeração e Ar Condicionado (ASHRAE) aprovou uma norma profissional voluntária intitulada AHSRAE 188 Legionelose: Gerenciamento de Riscos para Sistemas de Água em Edifícios. Esses dois eventos históricos trouxeram muito mais reconhecimento à Legionelose como um conjunto de doenças seriamente subnotificadas. É importante ressaltar que não existem normas ou regulamentações de saúde para a exposição segura à Legionella, pois as doses infectantes para pessoas saudáveis e imunossuprimidas são desconhecidas.
Transmissão e Epidemiologia
Onipresente em todos os ambientes aquáticos, Legionella As bactérias são encontradas em águas subterrâneas, águas municipais, bem como em águas superficiais doces, salobras e marinhas. Elas entram em nossos sistemas de encanamento, banheiras de hidromassagem e torres de resfriamento por meio dessas fontes de água. A menos que medidas de controle sejam realizadas de forma adequada e rotineira, o biofilme, a incrustação e a corrosão que aumentam com o tempo nesses sistemas protegerão o organismo e permitirão sua multiplicação.
A água contaminada proveniente de torres de resfriamento, banheiras de hidromassagem, nebulizadores, torneiras e chuveiros se transforma em aerossol. Quando uma pessoa suscetível inala o aerossol contaminado, pode ocorrer legionelose. A aspiração de água contaminada ou de fragmentos de gelo derretido também pode causar a doença. Legionella Pode causar uma forma muito grave de pneumonia (doença dos legionários), frequentemente acompanhada de sérios efeitos na saúde a longo prazo, ou pode causar uma doença leve e transitória semelhante à gripe, chamada febre de Pontiac. Podem ocorrer infecções sanguíneas, infecções de órgãos, infecções em válvulas cardíacas nativas e protéticas, próteses de quadril e joelho, além de infecções assintomáticas.
Os fatores de risco incluem idade, sexo (masculino), sistema imunológico comprometido e condições médicas preexistentes, como doença pulmonar obstrutiva crônica, câncer, diabetes, insuficiência renal, asma, uso de medicamentos imunossupressores e quimioterapia. Homens com mais de 50 anos de idade, imunocomprometidos, fumantes inveterados e consumidores de bebidas alcoólicas apresentam maior risco. No entanto, também foram relatados casos da doença em pessoas saudáveis, mais jovens e em mulheres. Recém-nascidos prematuros, imunocomprometidos ou que necessitam de ventilação mecânica também correm risco de infecção hospitalar. Bebês nascidos em banheiras de parto domiciliares abastecidas com água da torneira também desenvolveram doença do legionário, resultando em septicemia, falência de órgãos e morte.
Embora anteriormente se acreditasse que Legionella não era contagiosa; ocorreram 2 casos em Portugal que os investigadores suspeitam terem sido transmitidos do filho para a mãe, com base na ocorrência temporal das duas doenças e nas impressões digitais moleculares idênticas dos isolados obtidos das bactérias dos dois pacientes (Correia et al. 2016).
A legionelose é rotineiramente subnotificada. A maioria dos casos é causada por sistemas de água potável em edifícios e ocorre frequentemente em hotéis e instalações de saúde. Surtos que afetam um grande número de pessoas estão associados a torres de resfriamento. Para obter uma lista completa dos sistemas de água que foram associados a casos e surtos, consulte este link: http://www.legionellatesting.com/legionella-where-to-look.htm
Embora os surtos comunitários envolvendo torres de resfriamento e banheiras de hidromassagem recebam a maior atenção da mídia, estudos indicam que as fontes de água potável em edifícios são responsáveis pela maioria das infecções. Isso é particularmente verdadeiro em hospitais e casas de repouso, onde há um grande número de pessoas imunossuprimidas ou gravemente doentes. Por esses motivos, muitos departamentos de saúde estaduais têm diretrizes que recomendam o monitoramento de rotina para Legionella em hospitais de cuidados intensivos e lares de idosos. Em agosto de 2014, a Administração de Veteranos (VA) desenvolveu uma diretiva que exige que todas as unidades da VA com atendimento noturno implementem o monitoramento de seus sistemas de água potável. Também existem diretrizes preliminares para a prevenção da legionelose em sistemas de água prediais, elaboradas pela Sociedade Americana de Engenheiros de Aquecimento, Refrigeração e Ar Condicionado (ASHRAE).
Estatísticas divulgadas recentemente pelo CDC indicam que a taxa de mortalidade dos casos adquiridos na comunidade é de cerca de 10%, enquanto os casos adquiridos em ambientes hospitalares apresentam uma taxa de mortalidade de até 25%.
Escolhendo métodos de amostragem
Métodos adequados para coleta e análise de amostras são necessários para garantir resultados confiáveis, baseados no tamanho correto da amostra. Assegurar que um número representativo de amostras seja coletado também é crucial antes da interpretação dos resultados. Como as bactérias na água potável estão presentes em níveis muito baixos, os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) dos EUA recomendam uma amostra de 1000 mililitros (ml) de água potável. Esse tamanho de amostra permite a concentração das bactérias na água, possibilitando uma detecção e quantificação mais precisas. Muitas diretrizes profissionais recomendam a amostragem semestral de fontes de água potável.
Em fontes de água não potáveis, como a água de torres de resfriamento, uma amostra de 250 ml é suficiente. As diretrizes profissionais sugerem que essas fontes sejam monitoradas trimestralmente.
A amostragem deve ser realizada de forma a maximizar a recuperação do organismo e simular a via de exposição. Legionella As amostras devem ser coletadas em todos os locais onde possa ocorrer a formação de aerossóis na água.
No entanto, coletar amostras apenas da água provavelmente não identificará a verdadeira fonte do organismo. O reservatório real da bactéria é o biofilme ou lodo que sempre encontramos em nossos sistemas de encanamento, torres de resfriamento e banheiras de hidromassagem.
O biofilme (lodo) é composto por outras bactérias, algas verde-azuladas, amebas e protozoários. O biofilme protege Legionella da exposição direta à luz ultravioleta (UV), da dessecação e dos produtos químicos utilizados para controlar seu crescimento. Legionella As bactérias são ingeridas pelos protozoários e amebas e continuam a se multiplicar dentro desses organismos. A infecção desses organismos hospedeiros causa sua morte, liberando um grande número de bactérias. Legionella bactérias no ambiente circundante. É exatamente isso que acontece dentro do nosso corpo quando nossos macrófagos pulmonares são infectados por Legionella.
Porque o biofilme protege o organismo e aumenta a sua eficácia. Legionella Para garantir a multiplicação, a incorporação de swabs no seu protocolo de amostragem é muito importante. A coleta de amostras de biofilme por swab em reservatórios de torres de resfriamento, torneiras de água potável, chuveiros e filtros de banheiras de hidromassagem é necessária para obter um retrato fiel da presença de [informação faltante]. Legionella. Muitas vezes, as amostras de biofilme coletadas com cotonete demonstram a presença de Legionella indetectáveis apenas pela amostragem de água. A coleta de amostras de água potável e de máquinas de gelo com cotonete pode revelar Legionella contaminação devido à água parada.
Durante a coleta de amostras de ar para Legionella Embora imite a via de exposição, esse método de amostragem não é recomendado para projetos que não sejam de pesquisa. Durante a amostragem do ar, as bactérias provavelmente são eliminadas pelo impacto das células bacterianas no meio de coleta.
Legionella É improvável que sobrevivam à exposição à luz solar e à dessecação por longos períodos. A transmissão aérea de Legionella a partir de torres de resfriamento é maior durante períodos de dias nublados e com alta umidade, e após chuvas (Simmerling et al., 2017).
Ao coletar amostras, deve-se usar um respirador para partículas N95 ou HEPA, protetor facial ou óculos de proteção contra respingos e luvas impermeáveis. Ao coletar amostras de reservatórios de água quente, é prudente usar protetor facial, avental térmico e luvas térmicas e impermeáveis. Tome cuidado para não gerar aerossóis durante a coleta das amostras. Somente frascos estéreis e devidamente conservados, e swabs estéreis de Dacron (não algodão) fornecidos pelo laboratório, devem ser utilizados para a coleta das amostras. Garrafas de água potável devem ser conservadas com tiossulfato de sódio para neutralizar biocidas halogenados presentes na amostra de água.
Essas garrafas preservadas também devem ser usadas na coleta de água de torres de resfriamento que tenham sido tratadas com compostos de cloro ou bromo.
Após coletar a amostra de água, certifique-se de deixar um espaço de ar na garrafa. Legionella Os microrganismos necessitam de oxigênio para sobreviver; um espaço de ar dentro da garrafa garantirá que as condições aeróbicas sejam mantidas durante o transporte até o laboratório.
As amostras devem ser embaladas e enviadas de forma a minimizar a multiplicação de agentes não-Legionella bactérias. Recomenda-se o uso de uma caixa térmica com gelo para evitar temperaturas extremas durante o transporte. As amostras devem ser enviadas ao laboratório com entrega no dia seguinte.
Métodos Analíticos - Teste de Cultura
Legionella São bactérias aeróbicas e exigentes em termos de crescimento, com necessidades muito específicas. Duas dessas necessidades são a presença de ferro e L-cisteína. São fracamente gram-negativas e crescem lentamente em comparação com outras bactérias. Legionella são frequentemente reprimidas por bactérias de crescimento mais rápido. Seu crescimento pode ser inibido por algumas outras bactérias, mais comumente P. aeruginosa, que é comumente encontrado em biofilmes. Legionella Não devem crescer em meios microbiológicos padrão usados para contagem de placas aeróbicas ou em ágar seletivo usado para detectar outros microrganismos não aeróbicos.Legionella patógenos.
Atualmente, o método mais reconhecido nos EUA para identificar e quantificar Legionella em amostras clínicas e ambientais é o método de cultura. Este método utiliza um procedimento aprimorado desenvolvido pela Organização Internacional de Normalização (ISO). Ele incorpora concentração de rotina, tratamento ácido e tratamento térmico de todas as amostras de água potável e não potável para aumentar a recuperação de níveis muito baixos da bactéria. Legioneloem qualquer amostra. O ágar extrato de levedura com carvão ativado tamponado (BCYE) com antibióticos é a formulação base à qual são adicionados suplementos para controlar bactérias não-Legionella bactérias e recuperar mais Legionella espécies.
As amostras devem ser concentradas para recuperar baixas concentrações de Legionella. Isso geralmente é feito filtrando toda a amostra através de um filtro de membrana estéril. O filtro é então agitado em vórtex com água destilada estéril. Alíquotas são então retiradas para plaqueamento em 4 formulações diferentes de ágar BCYE. A água não potável geralmente apresenta uma alta concentração de bactérias que inibem o crescimento de Legionella. Desde Legionella Por serem mais resistentes a níveis de pH ácidos, essas amostras são pré-tratadas com uma solução ácida tamponada para eliminar os componentes não ácidos.Legionella bactérias.
Amostras contendo grandes quantidades de protozoários, como esgoto municipal ou efluentes de fábricas de papel, requerem pré-tratamento térmico. O pré-tratamento térmico é necessário para matar os protozoários e, assim, liberar o substrato. Legionella para que possam ser recuperados, cultivados e quantificados.
As placas BCYE são incubadas em
35-370 F (que é a temperatura corporal) em vez da temperatura ambiente. Já que Legionella As bactérias crescem lentamente, e os períodos de incubação especificados variam de 7 dias para confirmar um resultado positivo a, no mínimo, 10 dias para confirmar um resultado negativo. Por esse motivo, os métodos de cultura não podem ser acelerados.
Após 72 a 96 horas, as colônias são examinadas utilizando um microscópio de dissecção com luz ultravioleta. Legionella As colônias apresentam-se como colônias brancas convexas e circulares com um centro que lembra vidro fosco. Frequentemente exibem autofluorescência branco-azulada, verde ou vermelha.
Esses suspeitos Legionella As colônias são semeadas em placas de BCYE que não contêm ferro e cisteína. Se as colônias suspeitas não crescerem nessas placas de BCYE, elas são presumivelmente identificadas como Legionella.
As colônias presumíveis são então analisadas usando Anticorpos de Fluorescência Direta (DFA) ou Aglutinação em Látex para confirmar a identificação da espécie e identificar os sorotipos. Legionella Em amostras ambientais, o crescimento é lento; um resultado negativo confirmado deve ser fornecido somente após 10 dias.o dia de incubação.
Devido à reatividade cruzada e ao potencial de resultados falso-positivos e falso-negativos, o DFA deve ser usado apenas em colônias puras obtidas após incubação. De acordo com o CDC, o DFA não deve ser usado diretamente em amostras de água ambiental, como alguns laboratórios afirmam.
Embora se estime que 85% dos surtos nos EUA sejam causados por L. pneumophila sorotipo 1, existem outros sorotipos de L. pneumophila e até outros Legionella Espécies que podem causar a doença. Nem todos os laboratórios utilizam o mesmo método para isolar e identificar o organismo. Verifique se o seu laboratório utiliza o método que lhe proporciona o nível de identificação e quantificação necessário.
Nos Estados Unidos, os resultados do método de cultura são expressos em Unidades Formadoras de Colônias por mililitro (UFC/ml). Outros países geralmente expressam os resultados em UFC/litro (UFC/L). Embora seja prática padrão em microbiologia expressar os resultados em UFC/ml, isso pode ser confuso para quem não é microbiologista.
Métodos Analíticos - Reação em Cadeia da Polimerase
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um teste genético que procura o ácido desoxirribonucleico (DNA) específico para Legionella.Embora a PCR não seja considerada o "padrão ouro" para Legionella Na análise nos EUA, é muito útil para determinar rapidamente a presença ou ausência de Legionella em uma amostra. Como os resultados podem ser obtidos no mesmo dia, o rápido tempo de resposta pode ser útil para confirmar a presença de Legionella durante um surto, quando o tempo é crucial.
Ao contrário das análises de cultura, onde a variabilidade inter e intralaboratorial é alta, os resultados da PCR são reprodutíveis, precisos, exatos e muito sensíveis. O limite de detecção é, teoricamente, um único fragmento de DNA.
A PCR mede o DNA associado a células viáveis e não viáveis. Legionella. O método de cultura mede apenas as bactérias viáveis que crescem no meio seletivo.
A principal desvantagem da PCR é o potencial para efeitos da matriz da amostra. A presença de cátions divalentes comuns na amostra, como cálcio, magnésio ou prata, e a forma divalente do cobre, causará resultados falso-negativos, a menos que as amostras sejam processadas adequadamente. Isso exige que o laboratório tenha um programa de Garantia da Qualidade rigoroso que inclua controles positivos, negativos e da matriz da amostra.
Outras desvantagens da PCR são a incapacidade de identificar individualmente as 50 espécies conhecidas por causarem doenças e a incapacidade de identificar todos os sorotipos dessas espécies. Embora a maioria dos laboratórios de PCR consiga identificar L. pneumophila, Pode haver outras espécies ou sorotipos colonizando seu sistema de água ou causando a doença que você gostaria de identificar. Graças a um novo procedimento de teste, agora é possível identificar L. pneumophila sorotipo 1 por meio de PCR.
Pessoas sem formação em microbiologia frequentemente confundem os termos gênero, espécie, sorotipo e cepa. Esses são termos independentes para a identificação de organismos e cada um é usado para atingir um nível de identificação sucessivamente mais específico. (ou seja, Legionella pneumophila, sorotipo 1, Filadélfia é a identificação do gênero (Legionella), espécies (pneumophila), sorotipo (1) e cepa (Filadélfia) que causaram o surto de 1976 na Filadélfia.
O método de cultura fornece quantificação e identificação de Legionella espécies e sorotipos. Atualmente, o número limitado de laboratórios comerciais que utilizam PCR só identifica até o nível de espécie. Até o momento, o EMSL é o único laboratório comercial que possui um método de PCR validado para determinar a espécie e o sorotipo. Legionella spp., Legionella pneumophila, e Legionella pneumophila sorotipo 1 (Lp1) no mesmo teste. A identificação de espécies e sorotipos não é suficiente para determinar a fonte real da contaminação durante um surto. Durante uma investigação epidemiológica, é necessário empregar a identificação de cepas para determinar se as bactérias nas amostras clínicas correspondem às bactérias encontradas nas amostras ambientais.
Nos EUA, a eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) era o método mais comumente usado para identificar cepas dentro de L. pneumophila sorogrupo 1 e outras espécies. No entanto, técnicas moleculares mais recentes, como a Tipagem Baseada em Sequências (SBT), que analisa sete genes específicos dentro da Lp1, bem como o Sequenciamento de Genoma Completo (WGS), que pode discriminar entre os aproximadamente 3,4 milhões de genes da bactéria, são utilizadas pelo CDC, alguns departamentos de saúde estaduais e o Grupo de Trabalho Europeu para o Controle da Infecção por Plasmodium falciparum (EWG). Legionella Infecções (EWGLI) para subtipagem L. pneumophila Identificação do sorogrupo 1 e da fonte. O uso de PFGE e SBT não possui poder discriminatório suficiente para identificar cepas de Lp1 ou mutações genéticas em Lp1 ou em outras espécies e sorotipos. (LaPierre et al., 2017). Portanto, somente o sequenciamento de genoma completo (WGS) pode ser usado para rastreamento de origem. Até o momento da redação deste documento, o EMSL é o único laboratório de testes comercial que pode fornecer os dados brutos do WGS para serem usados no rastreamento de origem.
Objetivo do Monitoramento da Avaliação de Riscos
A intenção do seu Legionella A avaliação de risco determinará o tipo de dados necessários. O monitoramento proativo é realizado para determinar as condições e concentrações de referência. Legionella ou para validar a eficácia de um programa de manutenção existente na ausência de casos suspeitos de legionelose. Com esse tipo de monitoramento, obtém-se um resultado qualitativo, de presença/ausência, ou um resultado quantitativo. Legionella A indicação de "spp." é suficiente. A identificação da espécie e do sorotipo é opcional. A identificação da cepa ou subtipagem não é necessária.
O monitoramento reativo é realizado quando ocorre um caso suspeito ou confirmado de doença dos legionários. Nessa situação, a quantificação individual de espécies e sorotipos é necessária. Para uma investigação epidemiológica de um surto, somente o sequenciamento completo do genoma possui o poder discriminatório para determinar se as impressões digitais moleculares das amostras ambientais e clínicas estão relacionadas.
Quer a sua avaliação de risco seja proativa ou reativa, os resultados devem indicar predominantemente quantidades não detectáveis (ND) da bactéria.
A concentração real fornece informações úteis sobre o grau de contaminação. No entanto, deve-se entender que as concentrações são relativas e não representam um número absoluto. As populações bacterianas estão em constante mudança; as células bacterianas estão se multiplicando, morrendo ou entrando em estado dormente. Como as bactérias se multiplicam logaritmicamente, uma diferença de uma ordem de grandeza (10 vezes) nos resultados entre os períodos de amostragem é significativa. Uma diferença de algumas UFCs ou uma multiplicação de um dígito baixo nos resultados não é significativa. O objetivo é demonstrar um histórico de resultados não detectáveis ao longo do tempo.
Em resumo, o método analítico utilizado determina o tipo e a precisão dos resultados. Ao usar ágares BCYE para isolar Legionella Embora seja reconhecido como o “padrão ouro” mundialmente, ainda existem alguns laboratórios que utilizam outros métodos. Além disso, os reagentes e métodos utilizados para Legionella Os métodos de identificação não são padronizados. Isso torna a comparação de resultados de laboratórios diferentes muito difícil. Certifique-se de identificar o método de isolamento e os métodos de identificação utilizados pelo laboratório. Isso garantirá que você tire conclusões corretas ao comparar os resultados e também que obtenha o nível de detalhamento necessário.
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